| 中华首席医学网 2007年09月27日 22:44:30 Thursday
作者：熊顺华 龚坚 王君 曾凡龙 刘忠武
作者单位：郧阳医学院生理教研室，湖北 十堰 442000
《中国老年学杂志》2006年8月26卷8期 文章
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【摘要】 目的 探讨吡咯喹啉醌(PQQ)对培养鼠皮层神经元的促生长作用。方法 原代培养新生大鼠皮层神经元，观察PQQ对皮质神经元突起、胞体的生长和存活率的影响，测定MTT代谢率，免疫组化法观察cfos蛋白的表达。结果 PQQ处理后，皮层神经元突起的长度和胞体的长径显著大于对照组，细胞的存活率增加，尼氏小体的光密度值显著高于对照组，MTT代谢率增加，cfos的表达显著高于对照组。结论 PQQ能促进培养的鼠皮层神经元的生长，增加其存活率，延长存活时间。
【关键词】 PQQ 皮层神经元 生长
Promotion effect of pyrroloquinoline quinone on the growth of rat cortical neurons cultured in vitro
XIONG ShunHua, GONG Jian, WANG Jun, et al
Department of Physiology, Yunyang Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China
【Abstract】 Objective To investigate the promotion effect of pyrroloquinoline quinine (PQQ) on the growth of cortical neurons cultured in vitro.Methods Cortical neurons were primarily cultured in vitro to observe the effect of PQQ on the development of neurite and soma and survival rate of cortical neurons, and to detect MTT metabolic rate and the protein expression of cfos by immunohistochemical staining.Results The length of neurite and the maximum diameter of soma in PQQ group were longer than those of control group markedly. PQQ increased the survival rate of neurons and MTT metabolic rate. The optical densities of Nissl body and cfos expressions were markedly higher than those of control group. Conclusions PQQ could improve the growth and development of cortical neurons cultured in vitro and enhance the survival rate and prolong the survival time.
【Key words】 Pyrroloquinoline quinone (PQQ); Cortical neurons; Growth
吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一种氧化还原酶辅基，作为电子的供体和受体参与氧化还原反应及细菌呼吸链的电子传递过程，以PQQ及其家族成员为辅基的酶蛋白称为醌蛋白，目前已发现二十多种醌蛋白，如醇脱氢酶、葡萄酒脱氢酶等〔1，2〕；在多种微生物、植物、动物体内存在醌蛋白和PQQ，已证实人体组织和体液中也存在微量PQQ。PQQ还具有多种重要的生物活性，如刺激微生物、人体细胞和动植物的生长发育〔3，4〕；具有很强清除自由基的能力〔5〕； PQQ能促进培养的神经细胞和神经胶质细胞产生神经生长因子〔6〕。本文在培养新生大鼠皮层神经元上，观察PQQ对皮层神经元的促生长作用。
1 材料和方法
11 材料 吡咯喹啉醌（Sigma公司）以Hank′s液溶解，胎牛血清（杭州四季清），小牛血清（Gibco），DMEM/F12（Gibco），培养液成份：90%DMEM/F12，其中含5%小牛血清，5%胎牛血清，6 g/L葡萄糖。出生1～2 d的Wistar大鼠（郧阳医学院动物中心提供）。
12 皮层神经元的培养 取新生1～2 d的Wistar大鼠，断头后剪开头部皮肤和颅骨，取出两侧皮层组织，剪碎，置于0125%的胰蛋白酶中消化成单个的细胞，离心去上清，加培养液充分吹打分散细胞，以5×105接种于置有玻片的培养板上，置于CO2培养箱中培养。
13 实验分组 将培养12 h的神经元随机分为：对照组(培养液+Hank液)，（2）吡咯喹啉醌组〔于12 h后在培养液中加入不同浓度（终浓度为10-8、10-7、10-6、10-5）mol/L的吡咯喹啉醌〕。
14 神经细胞体突起长度和细胞体长径的测量 取加PQQ后12、36、48 h的细胞进行尼氏染色，各实验组随机选取50个细胞体染成蓝色的细胞，用LeicaQ500ZW彩色图像分析系统、测量其突起长度。取加PQQ后的第1、3、5天的细胞进行尼氏染色，各实验组随机选取50个细胞体染成蓝色的细胞，用LeicaQ500ZW彩色图像分析系统测量其胞体长径。
15 神经细胞存活率和尼氏体积分光度值的测定 取加PQQ后6、9、13 d的细胞进行尼氏染色，在倒置显微镜（10×20）下随机数20个不同视野中的活神经细胞数。用LeicaQ500ZW彩色图像分析系统测定细胞胞浆中尼氏小体的积分光度，每组随机测量50个神经细胞。计数的细胞胞体染成蓝色，有明显光晕、无核固缩、凝聚、胞膜完整、突起细长均匀、生长状态良好。
16 MTT代谢率的测定 取加PQQ后5 d的细胞加入MTT，每孔的终浓度为05 mg/ml，在孵育箱中放置4 h，弃上清液，每孔加入1 ml无水的二甲基亚砜，10 min后用酶标仪于570 nm处读取吸光度值，结果以样本OD值占对照组平均OD值的%表示。
17 免疫组化测定cfos的蛋白表达 取加PQQ 9 d的细胞，PBS冲洗，滴加小鼠来源的抗cfos 1 h，滴加羊抗鼠I gG30 min，DAB显色。用LeicaQ500ZW彩色图像分析系统测定细胞中的cfos的积分光度，每组随机测量50个神经细胞。
2 结果
21 皮层神经元的形态变化 镜下观察：细胞于培养24 h已经贴壁，胞体呈不规则形状，少部份细胞已开始有突起伸出，多为一个或二个突起，少见三个或多个突起，随着培养时间的延长，突起逐渐增多伸长、分叉，突起粗长，于培养的4～5 d连成网状；胞体逐渐长大，光晕轮廓明显，见胞核和核仁；但于培养7～8 d以后，一些神经细胞上出现粗大的颗粒，无明显光晕，还有些细胞出现核固缩、凝聚、断裂，形成凋亡小体；另一些细胞胞膜变得不完整，细胞碎裂、突起多处断裂，核碎裂而坏死；神经细胞的数量随着培养时间的延长逐渐减少，对照组于培养18 d左右时存活的细胞所剩无几。加PQQ处理后，神经细胞的生长速度明显加快，突起的生长速度明显快于对照组，于PQQ处理后32 h突起的长度显著长于对照组；胞体的生长速度快于对照组，于加PQQ后3 d胞体的长径显著长于对照组；存活的神经细胞数显著多于对照组，于培养18 d左右仍能见多个存活的神经细胞数（图1）。
在PQQ处理后16、32、48 h细胞突起的长度和1、3、5 d胞体长径的变化，1)P＜005，2)P＜001
图1 PQQ对神经细胞突起长度和胞体长径的影响（略）
22 PQQ对神经细胞MTT代谢率的影响 给予不同浓度（10-8、10-7、10-6、10-5）mol/L PQQ后5 d，其MTT代谢率与对照组相比,分别增加了815%，1537%，2667%，3444%（图2）。
图2 PQQ对皮层神经细胞代谢率的影响（略）
23 不同浓度的PQQ对皮质神经元存活率的影响和尼氏体积分光度值的变化 给予不同浓度（10-8、10-7 、10-6、10-5）mol/L PQQ后13 d，神经元的存活率（个/平均每视野）由对照组（1710±348）分别增加到（1903±323）、（2165±362）、（2570±440）、（2705±487）。尼氏小体OD值对照组为（014±006），10-6mol/L PQQ处理组为（022±008，P＜001）。
24 PQQ对皮层神经细胞cfos蛋白表达的影响 经cfos免疫组化染色后,可见免疫反应物呈棕黄色密集于细胞胞浆和细胞核中，核中免疫反应物更多，与对照组相比〔OD值为（027±004）〕，10-6mol/L PQQ处理后，cfos表达也显著地增加〔OD值为（036±006），P＜001〕，见图3。
图3 免疫组化分析cfos蛋白的表达（×400）（略）
3 讨论
在皮质神经细胞培养过程中，神经元的胞体逐渐变大并长出突起，随培养时间的延长，神经细胞先后逐渐衰老而自然死亡。但在培养液中加PQQ后，细胞的生长速度加快，存活时间延长，细胞的死亡率降低，此作用是剂量依赖性的，说明PQQ能促进皮质神经细胞的生长和存活。MTT代谢率是用于评价细胞线粒体功能的一项指标，PQQ处理组MTT代谢率显著高于对照组，说明PQQ能提高细胞的能量代谢。已有报道，PQQ可防止哺乳动物细胞线粒体的氧化损伤，防止呼吸链的非激活状态〔7〕，促进线粒体的生物氧化作用。PQQ处理组尼氏小体的光密度值显著高于对照组，说明PQQ处理组内神经元蛋白质的合成机能旺盛，细胞的代谢增强。PQQ能促进培养的神经细胞和神经胶质细胞产生神经生长因子，而神经生长因子作为营养因子对神经元胞体和突起的生长、存活、功能的维持发挥营养作用。cfos癌基因参与细胞的生长、分化、发育过程，多种生理和药理性的因素可影响其表达，cfos与cjun基因编码的蛋白质形成异二聚体，作为转录因子结合到基因启动子区的AP1位点而发挥作用，随着机体神经细胞的衰老，cfos的表达是逐渐降低的，cfos蛋白的表达量可作为反映神经细胞活力的一种指标〔8〕 。本文结果显示：PQQ能促进培养的细胞表达cfos蛋白，说明PQQ能提高细胞的活力，cfos蛋白还具有促进神经细胞胞体和突起生长作用。随着培养时间的延长，自由基产生逐渐增多，自由基可加速神经细胞的衰老死亡过程，而PQQ能清除自由基并能降低由NMDA受体介导的自由基产生〔9〕，降低自由基对神经细胞的损害作用。在皮质神经元的培养过程中，随着培养时间的延长，其胞内Ca2+浓度逐渐增加〔10〕 ，PQQ作用于NMDA受体，降低NMDA受体介导的Ca2+通道开放，降低细胞内Ca2+的升高〔11〕 ，延缓细胞的衰老，降低细胞的死亡率。 【参考文献】
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10 耿东进，蔡 琰，苏 敏神经细胞老化与细胞内Ca2+相关性的实验研究〔J〕中国老年学杂志，1994；14(5)：2945
11 熊顺华，李国华，李 清，等吡咯喹啉醌对谷氨酸诱发皮层神经元损伤的影响〔J〕中国老年学杂志，2005；25(4)：4335 |
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